Способ повышения активности сперматозоидов самцов осетровых рыб
Способ повышения активности сперматозоидов самцов осетровых рыб
Основная функция сперматозоида состоит в активации яйца, побуждении его к развитию, а также в снабжении гаплоидным ядром. В связи с этим подвижность сперматозоидов является одним из важных параметров, от которого зависит успех оплодотворения икры, что определяет успех технологии воспроизводства рыб. Основная роль в снабжении сперматозоида энергией принадлежит митохондриям, которые у рыб сконцентрированы в средней части сперматозоида. С функциональной точки зрения, подвижность сперматозоидов напрямую зависит от уровня АТФ, поэтому способность влияния на уровень АТФ может существенно изменить подвижность сперматозоидов.
Сперматозоиды являются популярным биологическим объектом для оценки влияния факторов физической и химической природы на качество мужских половых продуктов. Так увеличение срока хранения спермы индейки наблюдалось при добавлении витаминов Е и С, а введение цианокобаламина в криозащитную среду на начальных этапах криоконсервации спермы русского осетра повышает выживаемость и время движения сперматозоидов. Воздействие на сперму человека рентгеновским излучением угнетало, ультрафиолетовым излучением - не влияло, а инфракрасным излучением и электромагнитным полем - повышало подвижность сперматозоидов. Воздействие гамма-излучением на сперматозоиды крысы оказывало негативное влияние, а воздействие лазерным излучением красной области спектра повышало качество спермы индейки и собаки. Кроме того, воздействие на сперму телапии светом белой, а также красной областей спектра приводило к повышению подвижности сперматозоидов. Воздействие светом синей и ультрафиолетовой областей спектра оказывало отрицательный результат. Приведенные данные свидетельствуют о способности лазерного излучения и других источников света оказывать влияние на качество мужских половых продуктов.
Цель работы - определить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения в сочетании с магнитным полем на сперматозоиды осетровых рыб.
Материал и методика исследований. Исследования выполнялись на кафедре ихтиологии и рыбоводства УО БГСХА и в ГНУ «Институт физики им. Б. И. Степанова НАН Беларуси». Производственные исследования выполнялись в рыбном цеху осетрового завода «Акватория», на базе фермерского хозяйства «Василек» (д. Наквасы, Путчинский с/с, Дзержинский р-н, Минская обл.).
В качестве объекта исследований была выбрана сперма самцов гибрида бестера (Fj), выращенных от стадии личинки до половозрелого состояния в условиях установки замкнутого водоснабжения (частное хозяйство «Акватория», фермерское хозяйство «Василек», Минская обл.). Возраст самцов - 5 лет, средняя масса - 6,3 кг, средняя длина - 92,7 см. Работа с самцами включала следующие этапы: осенняя бонитировка, зимовка производителей, весенняя бонитировка, преднерестовое выдерживание производителей, гормональная стимуляция нереста производителей, получение зрелых половых продуктов. Осеннюю бонитировку маточного стада и старшего ремонта проводили при снижении температуры воды до 12°С, при которой рыбу прекращали кормить. Перевод производителей в режим зимовальных температур производили постепенно с температурным градиентом 2-3°С для самцов. Перевод в нерестовый режим был постепенным: с суточным градиентом при повышении температуры не более 2-3°С с периодами содержания при постоянной температуре.
Для инъекций использовали медицинские шприцы. Длину и диаметр иглы, а также объем шприца подбирали в зависимости от размера рыбы, дозы и типа препарата. Инъекцию производили в спинные мышцы между спинными и боковыми жучками на уровне 3-5 спинной жучки. При введении препаратов в мышечные ткани соблюдали осторожность и следили за тем, чтобы рыба при сжатии мышц не вытолкнула препарат.
Отбор спермы осуществляли при помощи катетера и пластикового шприца Жане. Для стимулирования созревания применяли препарат Нерестин 5-А в количестве 0,1 мг/кг. Средний объем эякулянта - 110 см3. Температура воды в период взятия половых продуктов - 14,5°С. Вся отобранная сперма оценивалась в 5 баллов по 5-балльной шкале Персова.
Сперма осетровых рыб подвергалась воздействию лазерного излучения в присутствии постоянного магнитного поля. Воздействие осуществляли поляризованным лазерным излучением красной области спектра Х=670±20 нм, плотностью мощности Р=3,0±0,2 мВт/см2 в сочетании с магнитным полем индукцией 50±5 мТл. Излучатель аппарата с магнитной насадкой располагали таким образом, чтобы сперма рыб находилась под проекцией магнитной насадки, а размер светового пятна соответствовал размеру слоя облучаемой спермы. При этом излучение лазера проходило через отверстие, расположенное в центре магнитной насадки. Мощность излучения (W) на выходе излучателя контролировали с помощью измерителя средней мощности ИМО-ЗС. Плотность мощности (в мВт/см2) излучения, воздействующего на слой спермы, определяли по формуле: Р = W/S, где W - средняя мощность излучения в мВт; S - площадь светового пятна (в см2) на уровне слоя спермы.
Затем проводили аналогичный эксперимент при выключенном лазерном излучении, когда на сперму воздействовало только магнитное поле.
Следующую серию экспериментальных исследований проводили для изучения воздействия на сперму лазерного излучения в отсутствие магнитного поля. С этой целью из лазерного излучателя извлекалась магнитная насадка и вставлялась расфокусирующая насадка, обеспечивающая аналогичную расходимость лазерного излучения, как и в случае использования магнитной насадки.
Для определения оптимального времени воздействия, оказывающего максимальный стимулирующий эффект на подвижность сперматозоидов осетровых рыб, воздействие физических факторов на сперму проводили в течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 с. После этого сперма помещалась на хранение в прохладное затемненное место. Температура хранения была не более 4-5 °С.
По истечении 24 часов проводили определение времени активности сперматозоидов (время поступательного движения сперматозоидов после активации водой). Для определения активности пробу спермы (10 мкл) наносили на предметное стекло, и при увеличении в 200 раз вначале исследовали без разбавления водой и определяли отсутствие (присутствие) примеси в пробах (форменные элементы крови, микроорганизмы, и пр.). Затем вносили каплю воды на предметное стекло, перемешивали со спермой, и на секундомере засекали начало активации сперматозоидов. При прекращении поступательного движения 90 % сперматозоидов время останавливали. У каждой пробы время поступательного движения определяли не менее 3-х раз.
По результатам полученных данных определяли величину стимулирующего действия физических факторов на время активности сперматозоидов: y=(to/tk) х 100 %, где to - время поступательного движения сперматозоидов после активации водой через 24 часа хранения после воздействия физических факторов (опытная группа), tk - время поступательного движения сперматозоидов после активации водой через 24 часа хранения без воздействия оптического излучения (контрольная группа).
Для статистической обработки использовали компьютерные статистические пакеты STATISTICA 8, BioStat 2009, OriginPro 8, Stat Plus 2007. Для соблюдения условий возможности применения параметрических статистических методов мы осуществляли проверку анализируемых данных на подчинение закону нормального распределения (распределение Гаусса). Проверку гипотезы о равенстве генеральных дисперсий проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни для независимых переменных. Для проверки гипотезы об отсутствии различий между сравниваемыми группами в целом использовали параметрический однофакторный дисперсионный анализ при условии нормального распределения анализируемого признака и однородности дисперсий. Для оценки различия показателей у исследовательских групп, использовали методы множественных сравнений (критерий Ньюмена-Кейлса) при условии нормального распределения и независимости выборок. В случае несоблюдений условий нормальности распределения использовали дисперсионный анализ Фридмана (для зависимых выборок) или Н-тест Крускала-Уоллиса (в других вариантах) с использованием медианного теста.
Результаты исследований и их обсуждение. Установлено, что воздействие на сперму самцов осетровых рыб лазерным излучением красной области спектра в сочетании с магнитным полем приводит к повышению активности сперматозоидов, что выражается в увеличении времени поступательного движения сперматозоидов после активации водой.
Воздействие постоянного магнитного поля 50±5 мТл на сперму самцов осетровых рыб приводит к повышению качества половых продуктов, что проявляется в увеличении времени активности сперматозоидов после активации водой. Однако стимулирующее действие постоянного магнитного поля являлось слабовыраженным. Максимальный эффект наблюдался при времени воздействия 60 с.
Более выраженное активирующее действие на сперму осетровых рыб оказывало воздействие лазерным излучением красной области спектра (лямбда =670 нм, Р=3,0±0,2 мВт/см2). При оптимальных условиях воздействия лазерным излучением в отсутствие магнитного поля время подвижности сперматозоидов составляло to =260,0±7,6 с (у=216,7±6,4 %) и наблюдалось при экспозиции t=40 с. Уменьшение или увеличение времени экспозиции приводит к снижению стимулирующего действия.
Однако наиболее выраженное активирующее действие на сперму осетровых рыб оказывало совместное действие лазерного излучения (лямбда =670±20 нм, Р=3,0±0,2 мВт/см2) и постоянного магнитного поля 50±5 мТл. При совместном действии указанных физических факторов максимальный эффект стимуляции наблюдался при времени воздействия 20 с и составлял у=245±6,8 % (to=294,0±10,2 с). Достаточно выраженным также являлось воздействие лазерного излучения и постоянного магнитного поля в течение 30 с: у=245±6,8 % (to =210,4±5,4 с).
Данный способ стимуляции подвижности сперматозоидов не является простой суммой двух известных способов, основанных на воздействии физических факторов. При воздействии только магнитного поля максимальное стимулирующее действие наблюдалось при экспозиции 60 с. При воздействии только лазерным излучением максимальное стимулирующее действие наблюдалось при экспозиции 40 с. При одновременном действии двух физических факторов максимальный стимулирующий эффект на сперму осетровых рыб наблюдался при экспозиции 20-30 с. Таким образом, при одновременном действии двух физических факторов оптимальное время воздействия ниже, чем каждого из них в отдельности. Синергизм действия двух физических факторов проявлялся в том, что эффект стимуляции при одновременном действии лазерного излучения и магнитного поля у=245±6,8 % в течение 20 с значительно превышал сумму эффектов у=101,9+153,1=155,0 % каждого из воздействующих факторов в отдельности: у=101,9±6,7 % (для магнитного поля) и у=153,1±2,7 % (для лазерного излучения). Все это свидетельствует, что данный способ обработки спермы рыб не является простой суммой двух известных способов. Характерно, что сперма, подвергнутая совместному действию лазерного излучения и магнитного поля, обладает более высокой способностью к оплодотворению икры. Так, если в случае использования интактной (контрольный вариант) спермы процент оплодотворения икры осетровых рыб составлял 75 %, то в случае использования спермы, обработанной описанным способом, процент оплодотворения икры достигал 87 %.
Заключение. Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет увеличить время подвижности сперматозоидов после активации водой и повысить вероятность успешного оплодотворения икры. Данный способ может использоваться в практике осетроводства с целью сохранения качества спермы самцов при длительном хранении без консервации в условиях, когда сбор спермы самцов уже осуществлен, а овуляция икры самок растягивается на продолжительное время.
Источник: Барулин Н. В. и др. Способ повышения активности сперматозоидов самцов осетровых рыб./ Животноводство и ветеринарная медицина. 2013, № 3, с. 14-18.
Материал на сайт подготовил Севастьянов В. Н.
