Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб

Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб

Изобретение относится к рыбной промышленности и может использоваться при искусственном воспроизводстве ценных видов рыб, в частности осетровых. Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб заключается в обработке протекторными растворами, эквилибрации, замораживании, оттаивании. Эквилибрацию осуществляют в течение 1,5 часов при температуре 14-18°С, а в качестве протектора используют смесь подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 при скорости замораживания 1500°С/мин. Оттаивание образцов осуществляют в дистиллированной воде при температуре 42-45°С в течение 45-75 секунд до достижения жидкой фракции. Использование заявленного изобретения позволит повысить качество дефростированных яйцеклеток осетровых рыб, а также создать криобанки с образцами генетического материала. Изобретение относится к рыбной промышленности и может использоваться при искусственном воспроизводстве ценных видов рыб, в частности осетровых, а также для создания криобанков с образцами генетического материала.

Известен способ замораживания ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (см. ст. Троицкий П.А. Замораживание ооцит-кумулюсных комплексов коров в витрификационном растворе с различной концентрацией криопротекторов. //Сб. ВИЖ «Актуальные проблемы биологии и воспроизводства», Дубовицы Быково, 2007. - С.122-124). Однако этот способ не обеспечивает высокой выживаемости яйцеклеток осетровых рыб, так как предусматривает использование протекторов, содержащих большее количество воды, которое не приемлемо для ооцитов рыб.

Техническая задача - создание способа криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб, обеспечивающего выживаемость половых клеток после двойного температурного шока.

Технический результат - повышение качества дефростированных яйцеклеток осетровых рыб. Он достигается тем, что в качестве протекторов используют смесь подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 при скорости замораживания 1500°С, оттаивание образцов осуществляют в дистиллированной воде при температуре 42-45°С в течение 45-75 секунд до достижения жидкой фракции.

Использование смеси подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 обеспечивает выживаемость дефростированных яйцеклеток рыб. Икринки с овариальной жидкостью обволакиваются смесью масел, предохраняя ее от действия воды, которая запускает дробление икры и делает процесс криоконсервации невозможным.

Скорость замораживания также имеет определяющее значение. Ступенчатые методы замораживания в данном случае не оказывают защитного действия на клетки. Поэтому использовали сверхвысокие скорости заморозки - 1500°С/мин.

Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб осуществляется следующим образом.

Работы по криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб проводили в Отделе аквакультуры и водных биоресурсов Южного научного центра РАН. Биологический материал заготавливали на осетровых рыбоводных заводах Астраханской области (Сергиевский, Житнинский, Александровский). Объектом исследований служила неоплодотворенная икра белуги, русского осетра, стерляди и бестера.

Перед началом работ всю необходимую посуду, икру, протекторы охлаждали до температуры 10-15°С. К охлажденной икре добавляли протекторную среду в соотношении 1:1. Процесс эквилибрации продолжался в течение 1,5 часов при температуре 14-18°С. Замораживание проводили в ампулах Эпендорфа, объемом 1,5 и 2 мл. Количество икринок в ампуле в зависимости от вида рыб составляло от 40 до 60 шт. Оттаивание образцов осуществляли в дистиллированной воде при температуре 42-45°С. Время отогрева до достижения жидкой фракции составляло 45-75 секунд. Для осуществления контроля за выживаемостью яйцеклеток после оттаивания икринки отмывали в естественной воде при нерестовых температурах (14-18°С) и оплодотворяли спермой. Оплодотворение осуществляли в чашках Петри. Количество спермы рассчитывали в соответствии с рыбоводными нормативами, время оплодотворения - не более 5 минут. После оплодотворения икру не обесклеивали (методика Коханской Е.М., 1980), что удобно при экспериментировании на малых количествах материала, и через 15 минут (после появления клейкости) регистрировали количество приклеенных к дну чашки Петри икринок в процентах. В качестве контрольного образца использовали икру от тех же особей, при аналогичных манипуляциях без обработки смесью жиров. Всего реализовано по 10 опытов на икре белуги, русского осетра, стерляди и бестера. В результате использования нового способа криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб удалось получить от 50 до 85% живых дефростированных клеток (в контрольных образцах живых клеток не обнаружено).

Источник: Тихомиров А. Н. Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб. / Патент на изобретение № 2460284. Опубликовано 10.09.2012 г. www: Ru-Patent.info

Материал на сайт подготовил Севастьянов В. Н.