Применение методов культуры тканей и органов in vitro для размножения исходного клонового материала винограда

Применение методов культуры тканей и органов in vitro для размножения исходного клонового материала винограда.

Экономическая эффективность и ста­бильность виноградарства в значи­тельной степени определяется качеством посадочного материала, которое зависит от биометрических показателей саженцев, гене­тического потенциала сорта, клона, их про­дуктивности и качества.

Виноградарские страны мира перешли на производство и закладку промышленных виноградников только сертифицированным посадочным материалом, который обеспечивает высокую приживаемость саженцев, в дальнейшем - выравненность кустов по силе роста, развитию, вступлению в плодоношение, урожайности и долговечности.

Посадочный материал винограда большин­ства европейских стран, в том числе и Украины, подразделяют на три категории: исход­ный, базовый и сертифицированный. Исходный материал является результатом на­чального размножения клонов, используется для создания базовых маточных насаждений подвойных и привойных лоз. Саженцы категории «исходные клоновые» могут быть корнесобственными. Это связано, в первую очередь, с ограничением поражения данного материала вредоносной инфекцией, которая может быть занесена вторым компонентом прививки - подвоем. Базовый посадочный материал происходит от исходного клонового и представляет собой этап промежуточного (на­копительного) размножения. Его используют для создания сертифицированных маточных насаждений подвойных и привойных лоз. Сертифицированный посадочный матери­ал получают при размножении базового и используют для закладки промышленных насаждений винограда. Саженцы категорий «базовые» и «сертифицированные» должны быть только привитыми.

Посадочный материал категории "исход­ный клоновый" выращивают, как правило, в научно-исследовательских учреждениях. Он имеет самые высокие селекционные показатели и представлен небольшим количеством растений. В связи с этим для его получения используют все известные методы ускорен­ного размножения, и в первую очередь, метод культуры тканей и органов in vitro. Он по­зволяет в короткие сроки размножить и полу­чить генетически однородный исходный по­садочный материал, свободный от вирусной и бактериальной инфекции.

Сегодня общая технология размножения винограда in vitro известна и включает следующие этапы: отбор и стерилизацию первичных эксплантов; введение эксплантов в культуру in vitro; пролиферацию почек и индукцию раз­вития побегов; укоренение микрочеренков на питательных средах и субстратах; адаптацию микрорастений из условий in vitro к условиям in vivo; доращивание саженцев до стандарта. Но, к сожалению, эта технология без применения дорогостоящих климатических камер, современных теплиц с регулируемым гидротермическим режимом обеспечивает невысокий выход стандартных саженцев со школки, который со­ставляет в среднем 30-40 %. Поэтому исследо­вания, направленные на оптимизацию приемов размножения винограда in vitro, являются ак­туальными в виноградном питомниководстве Украины, в частности, для производства исход­ного клонового материала винограда.

В Национальном научном центре «Институт виноградарства и виноделия им. В.Е. Таирова» разработана современная целостная система размножения винограда in vitro, которая пред­полагает: применение более эффективной си­стемы стерилизации инициальных эксплантов винограда, усовершенствование этапа их уко­ренения, использование заменителей агара и ионообменного субстрата «Биона», усовершенствование адаптации микроклонов винограда к условиям in vivo. Физические параметры культивирования микрорастений в культуральном помещении - общепринятые для культуры винограда.

Для введения материала винограда в куль­туру in vitro можно использовать зеленые побеги кустов, которые растут в полевых усло­виях и условиях защищенного грунта, а так­же те, которые получают при проращивании вызревшей однолетней лозы в осенне-зимний период. Для введения винограда в культуру тканей in vitro целесообразно использовать инициальные экспланты (верхушки побегов и одноглазковые черенки), взятые с 3 и 4 узла молодого побега, размером 0,8-1,0 см.

Обязательным условием введения исходно­го материала в культуру in vitro является его стерилизация. Растительные экспланты, как правило, стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Na, сулемой); перманганат калия, перекись водорода, спирт, нитрат сере­бра, диацид, антибиотики, хинозол. Со­гласно нашим исследованиям и полученным результатам, мы рекомендуем использовать ступенчатую стерилизацию инициальных экс­плантов винограда, в которой в качестве де­зинфицирующих веществ используют новые вещества - Дезефект и Дезавит, а также этанол и гипохлорит натрия. Схема стерилизации сле­дующая. Отобранные инициальные экспланты тщательно очищают от покровных тканей, чешуек, промывают в мыльном растворе и чистой водопроводной воде, 20 мин. стерилизу­ют в растворах Дезавита (5,0 % концентрации) или Дезефекта (3,8 % концентрации). Затем их 5-7 минут выдерживают в растворе «Белизны», разведенной с дистиллированной водой (1:5), 10-30 сек. в 70 % этиловом спирте. После этого проводят трехразовое промывание материала автоклавированной дистиллированной водой. Применение такого способа стерилизации по­зволяет уменьшить количество инфицирован­ных инициальных эксплантов до 6-8 %.

На первом этапе культивирования вино­града in vitro для стимуляции процессов пролиферации пазушных почек и апикальных меристем используют модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением 0,2-0,3 мг/л цитокинина 6-БАП.

Важным этапом в технологии размноже­ния растений in vitro является укоренение микрочеренков. Успех укоренения за­висит от многих факторов: сортовых осо­бенностей, числа пассажей, концентраций фитогормонов и способов их применения. Сегодня для индукции ризогенеза экс­плантов используют фитогормоны ауксиновой природы - ИМК (индолил-3-масляная кислота), ИУК ф-индолилуксусная кислота), НУК (а-нафтилуксусная кислота), которые в определенных количествах вводят в пита­тельные среды. Но некоторые исследователи отмечали их положительное влияние только на первых этапах ризогенеза, а в дальнейшем их присутствие в среде для развития корневой системы не только бесполезно, но и нежелательно и должно быть ограничено во времени. В связи с этим для успешно­го укоренения микрочеренков винограда мы предлагаем использовать безгормональную среду МС, с применением ауксинсодержащей тальковой пудры. Суть способа заключается в следующем: сформированные микроклоны винограда разрезают на одноглазковые черенки и каждый черенок высаживают на све­жую питательную среду. Перед посадкой одноглазковых черенков на питательную среду их базальную часть увлажняют стерильной водой, с помощью фильтровальной бумаги  слегка просушивают, окунают в изготовленную пудру и высаживают на безгормональную питательную среду. В процессе проведения таких исследований была установлена бо­лее высокая эффективность применения приема опудривания микрочеренков, с по­следующим их культивированием на безгормональной среде МС, чем их культиви­рование на среде, в состав которой входила ИУК (контроль). Через 30 дней культиви­рования в опытных вариантах практически все экспланты (90-100 %) образовывали корни, а в контроле - только 80 %. Микро­растения в опытных и контрольных вариан­тах различались по количеству корней и их длине. Так, например, у каждого экспланта подвойного сорта РхР 101-14 в контроль­ном варианте образовывалось в среднем по 3,0 корня, у микрорастений, которые перед посадкой на безгормональные питательные среды опудривали пудрой с содержанием ИУК- 6,0 корней. Положительные результаты по укоренению эксплантов винограда в культуре in vitro были получены также на питательной среде МС с по­ловинным содержанием макросолей (50 мл/л питательной среды) и хелата железа (5 мл/л пи­тательной среды). Например, через 45 дней куль­тивирования эксплантов на таких питательных средах мы отмечали формирование растений высотой 5,6 см (МС с половинным содержани­ем макросолей) и 6,0 см (МС с половинным со­держанием хелата железа), которые имели по 5 корней. После культивирования микроклонов на питательной среде МС эти показатели составля­ли 7,5 см (высота растений) и 3,0 шт. (количество корней). На этом же этапе для повышения рен­табельности производства, в качестве желирующего агента мы рекомендуем использовать пи­щевые крахмалы - кукурузный, картофельный в количестве 70 г/л питательной среды.

Известно, что в технологии размножения винограда in vitro наиболее ответственным этапом является адаптация микрорастений к условиям in vivo. Низкий уровень приживаемости микрорастений винограда связан с на­рушением деятельности устьичного аппара­та листьев, отсутствием кутикулярного слоя, корневых волосков и другими причинами. И, как следствие, часть микрорастений в процессе адаптации погибает. Поэтому уже на этапе раз­множения необходимо создавать оптимальные условия для формирования хорошо развитой, полноценно функционирующей корневой си­стемы. Как показывают результаты наших ис­следований, этому способствует применение двухслойной питательной среды. Ее готовят на основе среды МС с содержанием агара 6,0-7,0 г/л путем добавления в культуральные емкости агроперлита при условии, что его слой будет не более чем 0,4 см. На такой питательной среде через 25 дней культивирования приживались 95 % инициальных эксплантов винограда. Про­ведение учета биометрических показателей роста и развития микрорастений через 60 дней культивирования показало, что высота стебля растений составляла 12,9-14,1 см, количество листьев 10-12 шт., в контроле (стандартная сре­да МС) высота стебля растений составляла 12,5 см, количество листьев 8,0 шт. Следу­ет отметить, что на модифицированной среде корни формировались активнее, их количество составляло 11,5-15,3 шт. со средней длиной 9,0-11,6 см, что на 50 % больше по сравнению с культивированием на стандартной среде МС.

Нашими исследованиями установлено, что на этапе адаптации микрорастений винограда к нестерильным условиям целесообразно при­менять препараты группы антитранспирантов, гидроабсорбентов и влагоудерживающие суб­страты на основе кокосовой стружки. По это­му способу, для адаптации отбирают микро­растения винограда высотой 4-5 см, которые имеют по 3-5 листовых пластинок и хорошо развитую корневую систему. Первый этап адаптации проводят в условиях культурального бокса на протяжении 5-7 дней. Адаптируют микрорастения к условиям сниженной влаж­ности воздуха путем ежедневного открыва­ния крышек емкостей на 5-10 мин, с каждым днем увеличивая экспозицию. Перед первым открыванием крышек проводят опрыскива­ние вегетативной массы растений растворами антитранспирантов - Vapor Gard (0,3 % концентрации) или ЭПАА (экзополисахаридакриламид) (0,4 % концентрации), поверхность пита­тельной среды увлажняют дистиллированной автоклавированной водой. На втором этапе адаптации микрорастения винограда переносят в адаптационные помещения и пересаживают на питательные субстраты. В своей работе мы изучали несколько типов питательных субстра­тов: кокосовый субстрат чистый, кокосовый субстрат + вермикулит (1:1) + теравет (3:1), кокосовый субстрат + агроперлит (1:1) + теравет (3:1), торф сфагнум + агроперлит (1:1), торф сфагнум + вермикулит (1:1).

После пересадки в емкости на вышеуказан­ные влагоудерживающие субстраты микро­растения винограда повторно опрыскивали растворами антитранспирантов - Vapor Gard или ЭПАА и культивировали в адаптацион­ной комнате еще 20-25 дней, после чего высаживали в школку защищенного грунта на минеральный цеолитовый субстрат. Проведе­ние учета приживаемости растений в школке показало, что после применения смеси коко­сового субстрата с вермикулитом, агроперлитом, тераветом и смеси сфагнового торфа с вермикулитом количество прижившихся рас­тений увеличивалось до 97%. В конце периода вегетации саженцы этих вариантов характеризовались и лучшими биометрическими показателями развития. Так, средняя длина побегов у растений составляла 224,8-245,5 см, диаметр побегов - 0,55-0,58 см. По ГОСТу 4390:2005 «Саженцы винограда и черенки виноградной лозы», длина побегов корнесобственных саженцев, полученных через культуру in vitro, должна составлять не менее 40 см, а диаметр на этой высоте - 0,3 см. Выход стандартных саженцев со школки составлял в среднем 80-87 %.

Таким образом, представленная техно­логия производства посадочного материала винограда категории исходный клоновый обеспечивает высокий выход стандартных саженцев со школки. Качество полученного посадочного материала полностью соответ­ствует параметрам ГОСТа 4390:2005 «Сажен­цы винограда и черенки виноградной лозы. Технические условия».

Источник: Мулюкина Н. А., Зеленянская Н. Н., Джабурия Л. В. Применение методов культуры тканей и органов in vitro для размножения исходного клонового материала винограда. / Садоводство и виноградарство. 2013, №2, с.36-40.

Материал на сайт подготовил Севастьянов В.Н.