Использование пробиотика БПС-44 с целью предупреждения токсического влияния гербицидов на рыб
Использование пробиотика БПС-44 с целью предупреждения токсического влияния гербицидов на рыб
Многочисленные исследования, проведенные в лаборатории экологической физиологии и биохимии водных организмов Черниговского национального педагогического университета имени Т.Г. Шевченко показали неблагоприятное влияние гербицидов на организм карпа. Степень патологии на разных уровнях организации рыб зависит от физико-химических свойств гербицидов, их растворимости в воде и в органических растворителях, от значений Log Р, от распределения в водной среде, дозы и длительности действия гербицида, а также от вида, породы, возраста рыб и присутствия в воде других загрязнителей. В прибрежных акваториях и в пресных водоемах фиксируется наличие ядохимикатов в тех случаях, когда поблизости используют большое количество пестицидов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и древесной растительности. Самым продаваемым в мире гербицидом в настоящее время является «Раундап» (производитель - компания «Монсанто»), так как он применяется на трансгенных растениях, а большая их часть имеет устойчивость к этому химикату. Резистентность к «Раундапу» является основной целью генной модификации более 70% существующих сегодня ГМ-культур. Было показано, что гербицид «Раундап», к которому устойчивы наиболее распространенные ГМ-культуры, даже в самых минимальных количествах (0,000001%) приводит к гибели клеток эмбрионов, клеток пуповинной крови и плаценты человека, запуская апоптоз (запрограммированную смерть клеток). Обработка соевых бобов гербицидами проводится с помощью самолета, поэтому определенная их часть попадает в близлежащие водоемы, в организм гидробионтов и далее — в пищу человека.
Целью работы было установить возможность использования пробиотика БПС-44 для предотвращения токсического влияния глифосата на показатели белковых фракций в сыворотке крови и печени сеголеток карпа чешуйчатого. Известно, что применение данного пробиотика приводит к улучшению протекания зимовки карповых рыб и повышению жизнеспособности икры рыб в условиях гербицидного загрязнения.
Эксперименты проводились в лаборатории экологической физиологии и биохимии водных организмов Черниговского национального педагогического университета имени Т.Г. Шевченко на сеголетках карпа Cyprinus carpio, выращенных в ОАО «Черниговрыбхоз». Рыб содержали в 200-литровых аквариумах с отстоянной водопроводной водой, которую постоянно аэрировали и меняли через каждые трое суток. Величина рН составляла 7,50±0,25, содержание кислорода - 5,6±0,4 мг/л, температура воды выдерживалась приближенной к природной, в зависимости от сезона. Карпов в аквариумах размещали из расчета 20 л воды на одну особь в трех вариантах: 1) контроль; 2) действие 2 ПДК (предельно допустимая концентрация 0,04 мг/дм3) гербицида «Раундап» (действующее вещество - изопропиламинная соль глифосата, N-фосфонометил- глицин, 480 г/л); 3) при совместном влиянии пробиотического препарата БПС-44 (с концентрацией микроорганизмов Bacillus subtilis 44-р 1,25x10s КОЕ микробных клеток на 1 дм3 воды, которые добавляли в виде суспензии в воду аквариума за 1 сутки до глифосата) и 2 ПДК «Раундапа». Во всех вариантах эксперимента количество использованных рыб составило по 12 экземпляров. Пробиотический препарат БПС-44 был создан на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 44-p в Институте сельскохозяйственной микробиологии НААНУ, г. Чернигов. Во всех трех случаях в течение 14 суток эксперимента контролировали гидрохимический режим.
Материалом биохимического исследования была печень и кровь сеголеток карпа чешуйчатого. Для анализа навески замороженных тканей печени измельчали с помощью гомогенизатора РТ-2 и после центрифугирования (3000 об., 15 мин.) в центрифугате определяли количественные значения биохмических показателей. Использованный нами метод определения белковых фракций базируется на том, что фосфатные растворы определенной концентрации осаждают разные белковые фракции сыворотки крови с образованием очень мелкой эмульсии. По степени мутности растворов делали вывод о соотношении белков в исследуемом материале. В штатив помещали 7 пробирок (объемом 10 мл), обозначенных номерами 0, 1,2, 3, 4, 5, 6. В пробирку № 0 помещали 10 мл дистиллированной воды, а в пробирки № 5, 4, 3, 2, 1 - по 5 мл соответствующих фосфатных буферов: № 5 - 1,622 М, № 4 - 1,959 М, № 3 - 2,359 М, № 2 - 2,496 М, № 1 - 3,084 М (рН = 6,50 ± 0,10). В пробирку № 6 вносили 0,5 мл сыворотки, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл раствора основного фосфатного буфера (3,347 М, рН = 6,50 ± 0,10). Содержание пробирки перемешивали 5- кратным переворачиванием ее, избегая образования при этом пузырьков воздуха. Потом в пробирки с номерами 1-5 переносили по 0,5 мл полученной смеси, а в пробирку № 0 добавляли 1 мл ее. Содержания каждой пробирки аккуратно перемешивали и через 15 мин. замеряли оптическую плотность 5, 4, 3, 2-го и 1-го растворов против раствора из нулевой пробирки. Перед фотометрированием содержание всех пробирок еще раз тщательно перемешивали, аккуратно поднимая со дна осадок. Оптическую плотность определяли на фотоэлектроколориметре при 670 нм с использованием кюветы с оптическим путем 10 мм. Для вычисления оптической плотности альбуминов от показателя 1-й пробы отнимали показатель 2-й пробы. Для вычисления оптической плотности альфа 1- глобулинов от показателя 2-й пробы отнимали показатель 3-й пробы. Для вычисления оптической плотности альфа 2-глобулинов от показателя 3-й пробы отнимали показатель 4-й пробы. Для определения оптической плотности бета-глобулинов от показателя 4-й пробы отнимали показатель 5-й пробы. Показатель 5-й пробы - это показатель гамма-глобулинов. Дальше вычисляли соотношение каждой фракции в абсолютных процентах. Для исследования содержания белковых фракций использовали реактивы производства АО «Реагент» (Украина).
Результаты определения содержания белковых фракций в сыворотке крови сеголеток карпа соответствуют литературным данным попоказателям альбуминов и гамма- глобулинов. В содержании альфа- и бета-глобулинов наблюдаются некоторые отличия, обусловленные сезоном или физиологическим состоянием рыб. По данным К.Ф. Сорвачева, фракция альбуминов у чешуйчатого карпа составляет 15,70%, а у зеркального - 17,26%, фракция глобулинов составляет 84,30% и 82,74% у чешуйчатого и зеркального карпа соответственно. Согласно исследованиям В.Б. Адрианова (1937), альбуминово- глобулиновое соотношение (А/Г коэффициент) у карпа составляет 0,641 (0,481-0,886). Рассчитанный А/Г коэффициент в нашем исследовании в сыворотке крови составил 0,84.
Под влиянием глифосата в крови происходит резкое снижение содержания альбуминов (в 1,8 раза) и соответствующее возрастание aльфа-, и гамма-глобулинов. При нарушениях функционального состояния печени белковый сдвиг крови характеризуется возрастанием именно содержания глобулинов и снижением содержания альбуминов. В частности, известна способность альбуминов связывать различные вещества, в том числе токсические. Рост фракции глобулинов можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на выравнивание онкотического давления крови, которое снижается в результате патологического уменьшения выброса в кровь альбуминов (возможно, в результате нарушения их синтеза в печени). А/Г коэффициент составил 0,35, что также может свидетельствовать о хроническом поражении печени, о наличии воспаления, распространении процесса зернистой и вакуольно-капельной дистрофии. Кроме того, существенно возрастает (в 9,5 раза) содержание фракции aльфа 1-глобулинов, и снижается в 2,6 раза фракция бета-глобулинов (в эту фракцию входит трансферин - переносчик железа), гемопексин (связывает гем и препятствует его выведению почками и потере железа), компоненты комплемента и часть иммуноглобулинов, в 2,5 раза возрастают у-глобулины.
При использовании БПС-44 показатели альбуминов и бета-глобулинов в сыворотке крови приближаются к контрольным значениям, а коэффициент А/Г составляет 1,0, что может свидетельствовать о позитивных изменениях в организме рыб. Содержание гамма-глобулинов по сравнению с контролем также несколько возрастает (на 19,2%). Высокая обеспеченность организма альбуминами и гамма-глобулинами создает благоприятные предпосылки для оптимизации обменных процессов и гарантирует высокую неспецифическую резистентность. Однако наблюдаются определенные изменения во фракции альфа-глобулинов: содержание aльфа 1-глобулинов приближается к норме по сравнению с влиянием «Раундапа», но уровень альфа 2-глобулинов снижается еще больше.
В печени сеголеток карпа под влиянием «Раундапа» наблюдается рост относительного содержания альбуминов - на 17,0% и гамма-глобулинов - на 26,1% (в эту фракцию входят иммуноглобулины, которые функционально являются антителами и обеспечивают иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. Соответственно можно предположить протекание в организме рыб воспалительных процессов. Содержание остальных белковых фракций достоверно не отличается от контрольных значений.
Действие БПС-44 приводит к существенному изменению фракции альфа 1-глобулинов (фракция альфа 1- глобулинов преимущественно включает белки острой фазы: альфа 2-макроглобулин (принимает участие в развитии инфекционных и воспалительных процессов), гаптоглобин образовывает комплекс с гемоглобином, который освобождается из эритроцитов при внутреннесосудном гемолизе), церулоплазмин (специфически связывает ионы меди, а также является оксидазой аскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина, способные инактивировать свободные радикалы), а также аполипопротеин В (принимает участие в транспорте липидов) - наблюдается возрастание содержания этой фракции в 3,1 раза. Существенным является и снижение в 1,8 раза фракции альфа 1- глобулинов (эта фракция включает белки острой фазы: альфа 1-антитрипсин (ингибитор многих протеолитических ферментов), aльфа 1-кислий гликопротеин (в зоне воспаления способствует фибриллогенезу), транспортные белки, гамма-глобулины под влиянием БПС-44 тоже возрастают, хотя и не так существенно, как при влиянии «Раундапа», - на 18,9%. Такие изменения данной фракции также могут свидетельствовать о негативных иммунных реакциях организма сеголеток карпа.
Таким образом, полученные результаты показали, что действие гербицида «Раундап» приводит к негативным изменениям в крови сеголеток карпа: уменьшается процент альбуминов и возрастает содержание гамма-глобулинов как свидетельство наличия воспалительных процессов и снижения неспецифической резистентности организма карпа. Действие пробиотического препарата БПС-44 в сыворотке крови приводит к позитивным изменениям: наблюдалось выравнивание всех показателей белковых фракций, кроме фракции альфа 2-глобулинов.
Источник: Жиденко А. А. и др. Использование пробиотика БПС-44 с целью предупреждения токсического влияния гербицидов на рыб./ Рыбоводство и рыбное хозяйство. 2014, № 1, с. 53-59.
Материал на сайт подготовил Севастьянов В. Н.
